Dès 1935, Étienne Wolff entreprit, en collaboration avec A. Ginglinger, l’étude de la différenciation sexuelle chez l’embryon. L’une de ses premières expériences eut un retentissement considérable. Déposant sur les annexes membranaires d’embryons de poulets de cinq jours une solution huileuse de folliculine (hormone sexuelle sécrétée chez l’adulte par l’ovaire et dont on pensait qu’elle était sans action chez l’embryon), il constata que, parmi tous les embryons traités, il n’y avait aucun mâle typique mais seulement des sujets de sexe féminin ou des sujets intermédiaires entre les deux sexes. L’hormone avait féminisé les glandes génitales des mâles potentiels présents en nombre approximativement égal à celui des femelles potentielles dans l’ensemble des embryons traités. Cette inversion spectaculaire du sexe n’est cependant pas définitive car les animaux adultes retournent au sexe génétiquement déterminé. L’étude ultérieure des effets des hormones mâles montra qu’elles induisent seulement la transformation des canaux génitaux sans avoir d’effet sur les gonades. Chez les oiseaux, en effet, des expériences de castration précoce par irradiation limitée de la région prégénitale de l’embryon le démontrèrent. Le sexe «neutre », c’est-à-dire qui se différencie en l’absence d’hormones sexuelles, est le sexe mâle. C’est la sécrétion précoce d’hormones femelles qui détermine la différenciation du sexe femelle. Dans le but de soustraire gonades et appareil de la reproduction aux multiples influences qui s’exercent sur eux chez l’animal entier, Étienne Wolff, en collaboration avec K. Haffen, mit au point une technique de culture dans laquelle les structures tridimensionnelles de fragments embryonnaires étaient maintenues. Il put ainsi préciser in vitro les conditions requises pour la différenciation des gonades. Cette méthode de culture, dite organotypique, lui permit en outre de résoudre de nombreux problèmes. Il rechercha, en particulier, si certains des caractères d’organes adultes sont sexuellement déterminés. Il démontra qu’il en est ainsi, chez les femelles d’oiseaux, pour les faibles dimensions de l’organe du chant, la syrinx. En effet, des syrinx prélevées sur de très jeunes femelles et explantées in vitroprésentent un développement aussi important que celui des syrinx de mâles. Grâce à ce type de culture, il put aussi étudier les interactions entre tissus provenant de différents feuillets embryonnaires et même d’espèces différentes. Il montra que si les organes d’animaux adultes ne peuvent être cultivés de cette manière, les tumeurs cancéreuses, en revanche, sont indéfiniment cultivables en présence de fragments d’organes embryonnaires. Étudiant, par ailleurs, les phénomènes de régénération chez les Planaires, il démontra l’existence de cellules de régénération totipotentes dont il décrivit les propriétés.